一、實驗步驟
取 1ml 菌體發(fā)酵液，以 10000rpm 轉(zhuǎn)速離心 10min，去除上清液；
向離心管中加入 500μL TE 緩沖液懸浮沉淀，隨后加入 10-20μL 溶菌酶（Lysozyme），輕輕混勻后，置于 37℃環(huán)境下保溫 0.5h；
加入 30μL 10% 十二烷基硫酸鈉（SDS）、3μL 20μg/ml 蛋白酶 K（或 1mg 蛋白酶 K 干粉），充分混勻，在 37℃條件下保溫 1h；
加入 100μL 5mol/L 氯化鈉（NaCl）溶液，輕輕混勻；
加入 8μL CTAB/NaCl 溶液，混勻后放入 65℃水浴鍋中保溫 10min；
加入與上清液等體積的酚：氯仿：異戊醇混合液（體積比 25:24:1）進(jìn)行抽提，10000rpm 離心 5min，將上層清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；
向所得上清液中加入等體積的氯仿：異戊醇混合液（體積比 24:1）再次抽提，10000rpm 離心 5min，取上清液移至新的干凈離心管；
加入與上清液等體積的異丙醇，輕輕顛倒離心管使溶液充分混合，置于 - 20℃環(huán)境中靜止 20min 以沉淀 DNA，之后 10000rpm 離心 5min；
倒出離心管中的上清液，用 70% 乙醇漂洗 DNA 沉淀，吸干乙醇后，將沉淀溶解于 50μL TE 緩沖液中；
向最終的 DNA 貯存液中加入 1μL 核糖核酸酶（RNase），去除 RNA 污染。
通常情況下，通過上述實驗步驟可獲得 3-5μg 的基因組 DNA。
若因培養(yǎng)箱溫度不穩(wěn)定等因素，導(dǎo)致培養(yǎng)隔夜后未出現(xiàn)菌落，無需立即判定實驗失敗。建議延長倒置培養(yǎng)時間，例如培養(yǎng)至次日中午或更晚，培養(yǎng)皿上可能會出現(xiàn)菌落；
挑取菌落時，必須選擇單菌落，而非融合菌落。若培養(yǎng)皿上所有菌落均融合，需重新進(jìn)行劃板培養(yǎng)，直至獲得單菌落。若混入不同菌落，可能對后續(xù)實驗造成干擾；
微型離心柱回收的利弊分析：其原理與本實驗近似，核心區(qū)別在于 DNA 回收階段，不采用醋酸鈉 - 乙醇沉淀法，而是借助微型柱。該方法的不足在于，回收產(chǎn)物中常殘留痕量乙醇，可能抑制對乙醇敏感的酶的活性，給后續(xù)實驗操作帶來困難；
離心平衡要求：確保離心機(jī)轉(zhuǎn)子對面兩側(cè)試管孔內(nèi)，放置含有等量離心物的相同規(guī)格試管，以實現(xiàn)離心平衡。若僅需離心 1 支試管，需在對面試管孔中放置 1 支相同規(guī)格的試管，并加入與樣品等量的水；
DNA 離心通常采用 1.4 萬轉(zhuǎn) / 分鐘的轉(zhuǎn)速，離心 10 分鐘，該條件足以滿足 DNA 沉淀的需求；
沉淀 DNA 或 RNA 時，需將 Eppendorf 管蓋的連接蒂朝向外側(cè)，這樣離心后沉淀會位于管底靠近連接蒂的一側(cè)。當(dāng) DNA 或 RNA 量極少難以辨認(rèn)時，吸取上清液過程中，可避免吸頭觸碰該區(qū)域?qū)е鲁恋肀晃撸?/span>
室溫環(huán)境下，DNA 沉淀易浮起，因此整個實驗操作需在 4℃環(huán)境中進(jìn)行，操作時手指需持試管上部，避免接觸試管底部；
吸取上清液時，動作需輕柔且迅速；加入 75% 乙醇時，應(yīng)沿離心管壁緩慢加入，防止將 DNA 沉淀沖起；
若實驗對 RNA 污染無嚴(yán)格要求（如僅進(jìn)行酶切鑒定），可省略加 TE 緩沖液、RNase、醋酸鈉（NaAC）等步驟，以提高實驗效率；
離心后，大腸桿菌裂解物可能黏附在離心管壁或浮于離心液表面。為避免裂解物堵塞吸頭，可在推出吸頭內(nèi)氣體的同時，將吸頭插入含有大腸桿菌裂解物的離心液中；
加入溶液 I 前，可用 200μL 槍頭將離心管內(nèi)剩余的菌液徹底吸凈；
加入溶液 Ⅱ、Ⅲ 后，需輕輕顛倒離心管混勻溶液，嚴(yán)禁劇烈震蕩，否則易導(dǎo)致 DNA 斷裂；
單純使用乙醇沉淀 DNA 的效果較差，可考慮添加醋酸鈉等鹽類提升沉淀效果。加入 75% 乙醇的目的是清洗菌斑，若菌斑中殘留無機(jī)鹽，乙醇中的 25% 水分可溶解無機(jī)鹽，同時乙醇能置換出菌斑中的有機(jī)溶劑；
進(jìn)行 65℃水浴操作時，需打開離心管蓋子，使管內(nèi)乙醇等揮發(fā)性物質(zhì)充分揮發(fā)。
